プール血清の作り方とその意義について解説します【臨床検査】

みなさんこんにちは!

「Webサイトエンジニア」×「臨床検査技師」のハイブリットおじさんこと、ウエノです。

Webサイトエンジニアではありますが、現役で臨床検査技師を15年しています。

今回は「プール血清」についてお話します。

みなさんの施設ではプール血清を使っていますか?

プール血清は総合病院や大学病院のようなある程度、大きな施設で導入されていることが多いですよね。

おそらくこのブログを読んでいるみなさんは、プール血清についてこんな疑問を持っているとお見受けします。

困った表情のアイコン

なんで購入しているコントロール試料があるのにも関わらず、わざわざプール血清を作るんだろう。作り方には工程が多いけど、その理由は何なんだろう。作ってみたけどデータが安定しない…。

プール血清を導入していても知らないことはたくさんあると思いますし、導入していないならなおさらと思います。

そこでプール血清についての疑問に、生化学歴15年以上経過する僕がこのブログですべてお答えしていきます。

このブログを読み終えた頃、みなさんはプール血清についての深堀りされたノウハウを得られているので、その手の話になったときにドヤ顔で語れてしまうレベルになってしまっています。

これ以上ないくらいに内容を詰め込んでいますので、最後まで読んでぜひドヤってくださいね。

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【プール血清】とは

プール血清は患者血清をプール(集めて溜めること)して、補助的管理血清として精度管理に使用します。

手間や人手、プールする患者血清のサンプル数的な問題から、総合病院クラスから大学病院クラスあたりの中大規模の病院が使用することが多いです。

市販の精度管理物質を使用しながらもお手製のプール血清を採用する理由としては、反応性の問題が挙げられます。(ただ昔からの風習で作成している施設もあるかもしれませんが)

生化学の部署では管理する試薬が多く、必ず何かしらのマルチコントロール(多項目管理用血清)を使用しているわけですが、これには様々な薬品が添加されており、またベースとしているもの(ヒト血清、ウシ血清など)が違い、反応性にわずかながら影響を及ぼしてくることがあります。

この微妙な影響でいつも使用している試薬と精度管理物質の組み合わせであっても、両者のロットの組み合わせによっては管理幅から逸脱することがあり、全世界の検査技師の頭を悩ませています。

そこでプール血清の出番です。

プール血清は完全にヒト血清ベースであり、薬物・薬品の影響も限りなく小さいので、マルチコントロール測定で異常が生じたときに一つの判断基準として役に立つことがあります

もう一度いいますよ、「役に立つことがあります」!

絶対にではありませんので、そこは気を付けてくださいね。

というのも、プール血清はお手製のためやはりそのクオリティは計り知れません。(あっ、悪い意味ですよ)

データが安定したプール血清を作り上げるには「正しい知識」と「確かな機材」が必要なのです。

例えば、

  1. 濾過しきれていないため不純物質が多くて物質の変異や干渉が激しく、データが安定しない。
  2. 凍結融解がしっかりと行われていないため、アイソザイムの失活が不十分でデータが変動する。
  3. 分注前の攪拌が不十分でバイアル間差が出まくり。

1でいえば、濾紙の目が粗すぎたのか、ただ単に濾過の回数が少なったのか。

2でいえば、凍結融解の回数は十分だったのか。

3でいえば、スターラー(撹拌器)を持っているかどうかが勝負の分かれ目…といったように、「正しい知識」だけでなく「確かな機材」もないと、データが安定したプール血清は作れないのです。

ですので、どこの施設もデータの安定したプール血清を作れているかは怪しいところである、というくらいの認識でいたほうが良いでしょう。

「役に立つことがあります」についての理由はこんな感じです。

また、反応性への影響の原因が添加されている薬品やベースの性質ではなく、別の要因だったらプール血清もお役に立てないこともありますので、過度の期待はかけないであげてくださいね。

さらに補足として、「薬物・薬品の影響も限りなく小さい」というのは、プール血清は何十人もの患者血清を混ぜ合わせるので、1人や2人、10人の血清中に薬物成分が浮遊していてもどんどん薄まり続け、最終的には平均化されてほぼゼロに等しくなる、ということです。

プール血清は先にもいいましたがあくまで「補助的管理血清」的なポジションであり、信頼性は高くないので「マルチコントロール測定で異常が生じたときに一つの判断基準」として見るのが正しい運用といって良いでしょう。

試薬のロットが新しくなってマルチコントロールがはずれた…でもプール血清はいつもどおりの測定値を返している、となればマルチコントロールの反応性を疑うことができますね。

これこそがプール血清のその真価を発揮する最大の場面ですので、もしものときに備えて運用しておくのもリスクマネージメント的におすすめですよ。

【プール血清】の作り方

プール血清の作り方として、まずはどのデータ領域のものを作るのかを決めましょう。

データ領域というのは「正常域」を作るのか「異常域」を作るのか、ということです。

もちろん「どちらも作る」ことは大変素晴らしいことですが、異常域のプール血清を作るのはとてつもなく大変な作業になりますので、正常域オンリーが一般的です。

なにせ異常域のプール血清を作るとなると、異常域データを持つ血清を大量に、かつ高値をキープできるように厳選して用意しなければなりません。

普通の神経ならまずやりませんよね、大変過ぎます。

薄まることを考えて、測定項目すべて高値になるようにするなんてまず無理です。

マルチコントロールは薬品を使っているとはいえ異常域もしっかりと調整されていますので、こんなときになんですがその凄さがわかりますよね。

ということで、当院でも正常域オンリーで運用していますのでさっそくその作り方について解説していきます!

まずはプールする検体の選び方から解説します。

何でもいいわけではなく、正常域を目指すなら異常データが少なそうな健診検体や内科外来、外科外来、眼科外来の検体がおすすめです。

病棟の患者検体は異常データが多かったり、様々な薬剤を投与されていたりしますので、通常の血清とは異なる状況が多いため除外した方が賢明です。

干渉したり、残存していると血清に何かしらの影響を及ぼしかねかったりしますので、病棟の患者血清は極力除外しましょう。

それと見た感じ乳びがひどい、溶血している、ビリルビン色が強い、浮遊物があるなどの検体も避け、なるべくきれいなものを選びましょう。

できれば感染症陰性が望ましいですが、たくさんの患者データを確認しながらピックアップするのは大変ですので、素直にあきらめて良いでしょう。

大丈夫です、大量の検体を混ぜ合わせるので最終的には平均化されて陰性になりますから。

あまり神経質のならずに作りましょうね。

検体の選び方がわかったところで、次にプールする検体をピックアップして容器にプールしていきます。

で、「どのくらい検体を用意すればいいの?」となると思いますので、そのあたりから解説します。

用意する検体の本数は、プール血清の作成サイクルとデータ取りの日数に依存します。

当院での運用を例にして解説すると、プール血清の作成サイクルは5か月でデータ取りは20日分実施しています。

プールの作成サイクルというのは何カ月ごとにプール血清を作るのかということです。

僕の所感としては、当院では-80℃で保管していますが失活の関係なのか、生ものなので腐食の関係なのかはわかりませんが、作成から半年あたりで管理幅からはずれてくる割合が高くなってくるように感じています。

ですので、データ取り20日(約1か月換算)+使用4か月ということで作成サイクルは5か月にしています。

例えば1月にプール血清を作成し、2月にデータ取りを行い、3月に使用開始とすると、5月にまたプール血清を作成開始となり、7月から新しいプール血清で運用開始という流れになります。

ということで5か月分作れば良いということがわかりましたね。

次に1日使用量を検討してそれを5か月分でどれだけ使用するのかを計算します。

測定項目や測定機器、測定回数にもよりますが当院のように1日1回2台分測定となりますと、1日使用量はざっと600µLあれば足ります。

それを月曜日から土曜日の週6日間測定しますので、600µL×6日分ということで、1週間で3.6mL使用します。

参考に、当院では他の精度管理試料のバイアルを流水で洗ってその後乾燥させ、プール血清用に保管しておいて再利用しています。

バイアル

見覚えのある方も多いかもしれませんが、はい、sysmex社のQAPトロールのバイアルですね。

このバイアルには5mLくらい入りますので、これを1週間分として使用しています。

話を戻して、1週間の使用量がわかったところで次に月間での換算をします。

だいたいひと月に5週あるとして、1週間で3.6mL使用しますので3.6mL×5週間で18mL必要ですね。

最後に5か月分に換算します。

1か月に18mL必要で5か月分ですので、18mL×5か月分でトータル90mL必要なのがわかります。

しかし、この後の工程④で濾過を行うのですが、これがまたかなりの血清が濾紙に吸われていきます。

総量の半分くらい吸われます。いえ、マジです。

ということで、その濾紙に吸われる分や、何かしらのアクシデントも考慮して多めに用意しておくと安心です。

当院では大事をとって300mLくらい用意してから始めており、かなり余裕がありますがそのくらい余裕を持って集めておくと安心ですよ。

では、300mL以上入る容器を用意して集めた検体をどんどん流し込みましょう!

検体収集ボトル

ここでアドバイスとして、分離剤付近に溶血部が沈殿していることがよくありますので、そこをなるべく入れないようにデカント(検体を傾けて流し込む)で容器に流し込むと良いですよ。

要は寸止めです。検体を傾けて血清を流し込んで、溶血部が入りそうになったらすぐ戻すという感じで行うと良いです。

必要量のプールができたら、容器ごとそのまま冷凍庫に入れます。

冷凍庫に入れてカッチカチに凍ったら(凍結)、流水で解凍します(融解)。

完全に解凍したら、また冷凍庫でカッチカチに凍らせます。

この凍結→融解の工程を最低でも5回繰り返します

ちなみに臨床検査技師の六法全書といっても過言ではない(?)「臨床検査法提要」では、凍結融解の回数は「3回」と書いてありますが、僕は「5回以上」をおすすめしています。

回数が多ければ多いほど良いです。

なぜ凍結融解の回数が多ければ多いほど良いのかといいますと、それは凍結融解の意義が「アイソザイムの失活」だからです。

アイソザイムの失活が不十分だと、プール血清を作り終えて保存中している間にもアイソザイムの失活が激しく起き、バイアルごとに測定データにムラ(バイアル間差)がかなり出てきます

そうなると保存前に実施したデータ取りの測定データと合わなくなってしまい、使い物にならなくなってしまいます

ということで、凍結融解を「5回以上」しっかりと繰り返して、保存中の失活を最小限に抑えることを目指しましょう。

僕のこれまでの経験上、六法全書…じゃなかった、臨床検査法提要通りだとどうしてもムラが大きくなってしまいますので、検討を重ね最低でも「5回以上」が望ましいと結論付けています。

当院では、5回といわず気づいたら8回とか凍結融解をやっていることもあります。

じつはこの凍結融解がプール血清のデータの安定性を左右する大事な要素だったりしますので、しっかりと行いましょう!

ちょっと余談ですが、最近の若いのは臨床検査法提要を知らないんだよなー…。

臨床検査の全部門を網羅した、このブ厚い辞書を知らないなんてウソだろ…。

濾紙

凍結融解が5回以上終わったなら、次に漏斗と濾紙を用意して濾過を行います。

ボトルに濾紙をセット

どのくらい濾過を続けるのかというと、濾紙からスムーズに血清が落ちる程度になるまで続けます。

初めのうちは様々な成分や微小フィブリンのせいで目詰まりを起こしやすく、ぜんっぜん血清が落ちていきません。

その状態では毎回濾紙を新しくするくらいのお世話が必要ですが、次第にそれらが除去されていき、スムーズに血清が落ちていくようになります。

ルーチンの合間にちょくちょく濾紙を替えて、根気よくお世話してあげてくださいね。

データの安定したプール血清を作るためにも、ここでしっかりと余計な物を取り除いてください!

やっと仕上げです。

濾過し終わったプール血清を、ここまでブログを読み進めてきたみなさんならしこたま貯めておいたであろうバイアルに小分け分注していきます。

え?バイアルなんて用意してない?それは困りましたね。何か代用できるものをご自身でお探しください。

あまり代用品はおすすめしませんが、最悪、BMLのS-1スピッツあたりが良いですよ。

s-1スピッツ

S-1スピッツなら凍結にも耐えられますし、10mL入りますし、試験管立てにもすっぽりとはまって綺麗に保管できます。

ただ、みなさんの施設の責任者の方に確認してからにしてくださいね。勝手に使ってあとで怒られたとかやめてくださいね。

さて、小分け用の容器も用意できたと思いますので、さっそく分注していきましょう!

ところでみなさんはスターラーはお持ちですか?ないと超厳しいですよ。

スターラー

プール血清において1番重要なのはこの「小分け分注」です!

「え!?分注するだけなのにーっっっ!?」となると思いますが、じつはここで「正しい知識」と「確かな機材」がないと間違いなく失敗します。

失敗というか、バイアル間差でまくりの「使えないプール血清」ができあがります

冗談抜きでスターラーがないと、ここまでの努力がすべて無駄になってしまいます。

スターラーをお持ちでなく、でもプール血清を作りたい!な人は、上司に相談して買ってもらいましょう。

なぜスターラーが絶対的に必要なのかをいいますと、血清は本っっ当にとにかく混ざりにくいんです!

ガチャガチャと容器を激しく振ったところで、ぜんっぜん混ざっていません。

見た感じは色も均一でいかにも混ざっているように見えていても、目に見えない成分はぜんぜん混ざっていません。

このままバイアルに小分け分注しようもんなら、バイアル間差でまくりでまったく使い物になりません。

僕もスターラーなしでやったことがありますが、バイアル間差でデータが安定しなくてまったく使い物になりませんでした。

まだかけだしだった頃の僕はスターラーなんて持っていませんでしたし、存在すら知りませんでした。

さらに知識も乏しい身でしたので、なぜバイアルごとに測定データがバラつくのかなんてぜんぜんわかりませんでした。

もちろんプール血清作成の工程のそれぞれの意味も余裕で知りませんでしたし、考えたこともありませんでした。

ですので風習的に作っていたプール血清に「こんな手間もかかって使えないもの、いつまでも作ってられっか!」となり、作成を取り止めたこともありました。(先輩がことごとく退職されてしまい、僕の暴走を止める方がいなかったんですよ)

今思えば情けない限りですが、スターラーを使うかどうかでバイアル間差に圧倒的に違いがでてきます。

ということでみなさん、スターラーの用意はできましたよね?

スターラーセット

まずはスターラーにプール血清量の3倍以上はあるビーカーなり何なりの容器を乗せ、そこにマグネットを投下しプール血清を流し込みます。(ビーカーのサイズは何でも良いですが、プール血清の飛び跳ね防止のためなるべく大きいものが良いですよ)

400rpm(回転)くらいで10分間かき混ぜましょう。※あふれるようなら回転数を下げるより、より大きい容器を用意してください。あまり回転数を下げてしまうと混ざりませんよ?

よく攪拌できたら、そのまま攪拌している状態のまま分注します。

当院では1~10mLの可変エッペンを使用し、10mLにロックオンして分注しています。

エッペンドルフ

10mLくらいいっきに吸い上げることができれば何でも良いです。

何でも良いですと言っておきながら、じつは他にいっきに10mL吸い上げられるシロモノがあるのかどうかはわからないのですが、何食わぬ顔でそう言っておきますね。

吸い上げる時のポイントとしては、プール血清を超攪拌しながら吸い上げるわけですが、とにかく上層が泡だらけなので中層または下層を吸い上げると良いですよ。

まるでコップに注いだばかりのビールのようですので、泡を回避するのはほぼ無理ですが、なるべく中層、下層を目掛けてチップを挿入すると良いです。

それでも泡が結構入ってしまいますが、4~5mLくらいは泡のないところを吸えているはずですので、必要分は分注できるはずです。

これでプール血清の出来上がりです。

データ取りを20日間くらい行ってデータを集計し、さっそく使用開始といきましょう!

最後にそれぞれのバイアルに作成日とか使用期間を表記し、データ取りに使用しない分は冷凍庫に眠らせておきましょう。

バイアル
【まとめ】プール血清作成は「正しい知識」と「確かな機材」が必要です

まとめとして、プール血清作成の注意点をおさらいしておきます。

プール血清作成の注意点

  • 検体選びは正常そうな人の検体を選ぶこと。まちがっても病棟の検体は入れないこと。
  • 用意する検体量は必要量の2倍以上は準備すること。
  • 検体を1本1本容器にデカントするときは、溶血部分が入らないように「寸止め」する。
  • 凍結融解は5回以上やる。
  • 臨床検査法提要は検査技師の六法全書だ!
  • 濾紙はこまめに変えてスルスル落ちるまでやる。
  • スターラーは絶対に用意する。
  • 10mLいっきに吸えるのはエッペンドルフしか知らない
  • 子分注はスターラーで400rpm10分攪拌してから行う。
  • 超攪拌されてるプール血清がビールに見えても笑わない。(プール血清に失礼です)
  • スターラーで攪拌中のプール血清から吸い上げる時は中層、下層から吸い上げること。

です。

なにげにいろんな機材が要求され、知識もないと失敗するプール血清ですが、昔から作られている検査技師の伝統芸的存在です。

僕が入職したころ(2007年頃?)習ったプール血清の作成方法では、とにかくバイアル間差がでまくりで使い物にならなく「なんでこんなもん作らなきゃいけないんだ?」と疑問で仕方なかったプール血清ですが、研究に研究を重ねて「使えるプール血清」の作成方法を編み出しました。

長きに渡り研究してきた作成方法です。

この知識がシェアされ、みなさんが良きプール血清作成ライフを送れ、あるいは誰かにドヤ顔で語れていれば幸いです。

まちがいなく周りの知識レベルより一線を画すレベルの知識は得られていますので、たくさんの人にシェアしてもらえると嬉しいです。

これからはみなさんがプール血清について病院一詳しい人物になれているはずですので、リーダーとしてグイグイ引っ張って行ってください。

ところでみなさん、今の年収には満足していますか?

次のブログでは臨床検査技師における稼ぎ方をご紹介しています。

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また、そもそもプール血清は作る必要があるのか、という疑問にお答えするブログもありますのでそちらもどうぞ!

プール血清を作っている施設は多いと思いますが、そもそも本当にプール血清を作る必要はあるのでしょうか。このブログでは僕なりの結論とその理由をお話します。またプール血清についてまったくわからない人のために、プール血清の役割や存在意義も解説します。臨床化学を担当している人には絶対に読んでほしい内容です。

このブログがみなさまのお役に立てれば幸いです。

最後まで、ご閲覧いただきありがとうございました。

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